De nombreuses espèces animales, dont certaines protégées (castor, agrion de mercure, sonneur à ventre jaune …) ont été identifiées sur le tracé du CFAL. Mammifères, batraciens, insectes, poissons et oiseaux ont été rigoureusement répertoriés, puis les mesures nécessaires à leur protection définies.
Afin de rétablir les continuités écologiques, des aménagements spécifiques sont prévus : prolongement des passages grande faune déjà existants et réalisation de passages petit faune couplés aux ouvrages hydrauliques. Ces passages sont conçus de manière à inciter les animaux à les emprunter : des espèces végétales attirantes (fruitiers, arbustes à baies…) seront disposées en entonnoir jusqu’à l’entrée du passage.
Autres mesures : les défrichements prévus à Grenay et à Béligneux seront conduits en dehors des périodes de reproduction des oiseaux. Des mares pourront aussi être recréées pour proposer un habitat adapté aux populations animales déplacées.
La flore n’est pas oubliée. De multiples inventaires ont été réalisés afin d’identifier les espèces à protéger. Parmi elles, l’orchis parfumé : une variété d’orchidée à la subtile odeur d’anis ou de vanille.